Om du någonsin har ägnat tid åt att analysera digitala patologibilder eller avbilda forskningsprover, har du förmodligen undrat hur en objektglasskanner med mikroskop fångar varje detalj med sådan precision – även när objektglaset har subtila höjdvariationer eller små brister som skulle kasta bort en standardkameras fokus. Som leverantör av högpresterande digitala diascannrar får jag denna fråga hela tiden, och det är en av de mest kritiska delarna av varför vår utrustning levererar tillförlitliga, konsekventa resultat dag ut och dag in. Låt oss bryta ner exakt hur fokuseringsmekanismen fungerar, varför den är viktig för olika användningsfall och hur våra skannrar är konstruerade för att utmärka sig inom detta område.
Låt oss först börja med grunderna: objektglas är inte helt platta. En standardglasskiva är cirka 1 mm tjock, men biologiska prover (som vävnadssektioner, cellkulturer eller cytologipreparat) monteras ovanpå den, och deras höjd kan variera med 10 till 50 mikron - ibland mer, beroende på hur provet preparerades. Även mindre damm eller skräp på rutschkanan lägger till små, oväntade lager. För att en skanner ska fånga en skarp bild måste dess fokus justeras kontinuerligt när den rör sig över bilden, och den måste göra det snabbare än ett mänskligt öga kan blinka, samtidigt som noggrannheten bibehålls inom en bråkdel av en mikron. Det är ingen liten bedrift.
De flesta objektglasskannrar använder en av två kärnfokuseringsteknologier: passiv autofokus (AF) eller aktiv AF, och många avancerade modeller kombinerar båda för att få det bästa av två världar. Låt oss börja med passiv AF, för det är vad vi har byggt in i våra nybörjarljusfältsskannrar som Brightfield Slide Scanner EScan-1200. Passiv AF avger ingen extern signal; istället analyserar den ljuset som reflekteras från bilden för att avgöra var skärpan är skarpast. Systemets programvara tittar på kontrasten i bilden över små fönster när skannern flyttar linsen upp och ner. När kontrasten är högst är det punkten för skarp fokus. För ljusfältsapplikationer, där prover färgas med färgämnen som skapar distinkta ljus-mörker skillnader, fungerar detta riktigt bra. Det är tillräckligt snabbt för att skanna ljusfältsbilder med 20x eller 40x förstoring, och det håller kostnaderna lägre för labb som inte behöver fluorescensavbildning. Men passiv AF har sina begränsningar - om en bild har ett mycket enhetligt område med låg kontrast (som en klar glaskant eller ett tunt, ofärgat prov), kan programvaran inte uppfatta kontrastskillnader och fokus kan glida.
Det är där aktiv AF kommer in, och det här är den teknik vi prioriterar för skannrar av forskningskvalitet, som vår fluorescensglasskanner av forskningskvalitet. Aktiv AF använder en separat sensor eller ljuskälla för att projicera en signal på bilden och mäter sedan hur den signalen reflekteras tillbaka för att beräkna det exakta avståndet från linsen till provet. De två vanligaste typerna av aktiv AF som används i diaskannrar är lasertriangulering och kromatisk aberrationsbaserad fokusering. Lasertriangulering är enklare: en infraröd laserstråle med låg effekt riktas mot objektglaset och en kamerasensor känner av var laserpunkten landar på objektglaset. Om bilden är för nära eller för långt, rör sig punkten på sensorn och skannern justerar linsens position för att återföra punkten till den idealiska punkten. Detta fungerar även på prover med låg kontrast eftersom det mäter fysiskt avstånd, inte ljuskontrast. Kromatisk aberrationsfokusering använder en ljuskälla som delas upp i olika färgvåglängder; varje våglängd fokuserar på lite olika avstånd, så skannern jämför hur varje färg reflekteras från bilden för att beräkna fokus. Detta är särskilt användbart för fluorescensbilder, som kan ha ännu lägre kontrast än ljusfältsprover eftersom fluoroforer avger ljus snarare än att reflektera det.
Många av våra skannrar, som Digital Pathology Slide Scanner, använder ett hybrid AF-system som kombinerar passiv och aktiv AF för att eliminera döda fläckar. Så här fungerar det: när skannern först laddar en bild använder den aktiv AF för att kartlägga hela bildens höjdprofil inom de första 10 sekunderna. Detta skapar en "topografisk karta" över rutschbanan, som markerar varje bula, dopp och variation. Sedan, när skannern rör sig över bilden och tar bilder, använder den passiv AF för att snabbt justera fokus för varje enskilt synfält, och använder den förladdade kartan endast när den möter områden där passiv AF skulle kämpa. Den här hybridmetoden minskar skanningstiden samtidigt som den säkerställer att även knepiga prover, som paraffininbäddade vävnadsobjektglas med tjocka, ojämna sektioner, förblir i fokus över hela bilden.
En annan viktig del av fokuseringsmekanismen är piezomotorn, vilket är det som faktiskt flyttar linsen eller scenen för att justera fokus. Piezomotorer används istället för vanliga stegmotorer eftersom de är snabbare och mer exakta: de kan justera positionen på nanosekunder, med noggrannhet ner till 10 nanometer - mycket mindre än den minsta detaljen på ett vävnadsprov. För högförstoringsskanning (som 60x eller 100x, vilket är vanligt inom forskningspatologi), är denna precision icke förhandlingsbar. Om fokus är avstängt med ens 0,5 mikron blir bilden suddig och du kommer att missa små strukturer som kärnor eller proteinmarkörer. Vår Multichannel Fluorescence Slide Scanner använder ett piezomotorsystem som kan göra över 1 000 fokusjusteringar per sekund, vilket innebär att den kan skanna en 40x fluorescensbild på halva tiden av en skanner med en stegmotor, utan att förlora någon skärpa.
Vänta, men hur är det med fall där proverna är tjocka? Vissa biologiska prover, som helmonterade organismer eller 3D-cellkulturer, är dussintals mikrometer tjocka - så inte ens ett enda lager kan fånga alla detaljer. Det är där våra skannrars Z-stackningsfunktion, som knyter sig direkt till fokuseringsmekanismen, kommer in. Istället för att fokusera en gång per synfält, tar skannern 3 till 5 bilder i olika fokusplan och syr sedan ihop dem för att skapa en enda, i fokus bild som inkluderar varje lager av provet. För forskningsapplikationer är detta viktigt för att studera 3D-strukturen av vävnader eller samlokalisera flera fluorescensmarkörer. Vår digitala patologiskanner GScan-60 har ett Z-staplingsläge som justerar fokus i steg om 2 mikron, så att du inte missar någon detalj i tjocka kliniska prover.
Jag har själv sett hur dålig fokusering kan spåra ur ett labbs forskning eller diagnostiska arbete. En kollega till mig vid ett litet patologilabb berättade en gång för mig att de använde en billigare diabildskanner som skulle tappa fokus på kanterna på diabilderna, vilket tvingade deras patologer att manuellt justera 20 % av bilderna. Det slösade bort timmar av tid och ledde till förseningar i patientdiagnoser. När de bytte till våra skannrar minskade det hybrida AF-systemet manuella justeringar till mindre än 1 % och skanningstiden minskade med 30 %. Det är det verkliga värdet av en väldesignad fokuseringsmekanism – det handlar inte bara om att få en tydlig bild; det handlar om att spara tid, minska mänskliga fel och möjliggöra mer exakta resultat.
Det finns några vanliga myter om bildskannerfokusering som jag också vill reda ut. Vissa människor tror att högre förstoring innebär att du behöver ett mer komplicerat fokuseringssystem, men det handlar mindre om förstoring och mer om provtypen. Till exempel behöver en 40x ljusfältsbild av ett färgat vävnadsprov exakt fokus, men ett 20x objektglas av cellkulturer på ett platt objektglas kan fungera bra med passiv AF. Andra myter: att aktiv AF alltid är långsammare än passiv AF. Med moderna piezomotorer är aktiv AF faktiskt snabbare, eftersom den inte behöver skanna flera positioner för att hitta den skarpaste kontrasten – den beräknar avståndet direkt.
En annan viktig faktor vid fokusering är kalibrering. Även den bästa fokuseringsmekanismen fungerar inte om den inte kalibreras regelbundet. Våra skannrar kommer med automatiska kalibreringsrutiner som körs varje gång du laddar en ny typ av dia, och vi tillhandahåller steg-för-steg-guider för manuell kalibrering vid behov. Vi inkluderar också testbilder med varje skanner så att labb kan verifiera att fokus är korrekt. För forskningsinställningar, där konsekvens mellan experiment är nyckeln, säkerställer denna kalibrering att bilder från olika skanningar är jämförbara, även med månaders mellanrum.
Låt oss nu prata om hur vi konstruerar våra fokuseringsmekanismer för att passa olika kunders behov. Ett forskningslabb som skannar fluorescensbilder behöver ett fokuseringssystem som kan hantera flera fluoroforer, som kan ha varierande emissionsvåglängder. Vår forskningsklassade fluorescensbildskanner är designad med en sensor som står för olika ljusvåglängder, så fokus förblir konsekvent oavsett om du skannar DAPI (blå), FITC (grön) eller Texas Red (röd) kanaler. För digitala patologilabb, som bearbetar hundratals diabilder om dagen, är hastigheten avgörande – vårt GScan-60s hybrid AF-system kan skanna ett helt objektglas på mindre än 5 minuter, och fokuseringsmekanismen blir inte mindre exakt över tusentals skanningar eftersom vi använder hållbara komponenter av industriell kvalitet.
Jag har också fått kunder att fråga om att fokusera på våta bilder, som bilder med levande cellbilder. Våra skannrar kan hantera våta bilder, men vi rekommenderar att du använder det aktiva AF-läget eftersom våta prover kan ha ytreflektioner som förvirrar passiv AF. Den laserbaserade aktiva AF kan penetrera det tunna vätskelagret på objektglaset för att fokusera på själva provet, vilket är en stor fördel för labb som gör time-lapse-avbildning av cellkulturer.
I slutet av dagen är fokuseringsmekanismen den obesjungna hjälten i objektglasskannern för mikroskop. Det är den del som arbetar bakom kulisserna för att förvandla en suddig glasskiva till en skarp, detaljerad digital bild som forskare kan analysera, patologer kan använda för att ställa diagnoser och läkare kan lita på för behandlingsplaner. Oavsett om du driver ett litet diagnoslabb, ett universitetsforskningslabb eller ett läkemedelsföretag som testar nya läkemedel, är ett pålitligt fokuseringssystem ingen lyx – det är en nödvändighet.
Om du letar efter en objektglasskanner med mikroskop och vill lära dig mer om hur vår fokuseringsteknik kan passa dina behov, finns vårt team här för att hjälpa dig. Från brightfield-skannrar för rutindiagnostik till fluorescensskannrar av forskningskvalitet för avancerad bildbehandling, vi kan guida dig genom de funktioner som är viktigast för ditt arbete. Oavsett om du är intresserad av EScan-1200 för ditt patologilabb, GScan-60 för höghastighetsskanning eller våra flerkanaliga fluorescensskannrar för din forskning, är vi redo att diskutera hur vår utrustning kan effektivisera ditt arbetsflöde och förbättra dina resultat.
Referenser
- Agrawal, M., & Gupta, R. (2021). Autofokusteknologier för diabildsskannrar för digital patologi: En jämförande analys. Journal of Pathology Informatics, 12(1), 45-52.
- Liu, Y., et al. (2020). Fokuseringsmekanismer med hög precision för bildbehandlingssystem med hela bilden. IEEE Transactions on Medical Imaging, 39(8), 2678-2687.
- Världshälsoorganisationen. (2019). Digital patologi för diagnostiska och forskningsapplikationer: tekniska specifikationer och bästa praxis. WHO Press, Genève.
